Thèse: François Durupt - Construction et évaluation fonctionnelle de vecteurs adénoviraux oncolytiques armés exprimant des protéines hyperfusogènes du virus par

Thèse François Durupt - VirPath

Construction et évaluation fonctionnelle de vecteurs adénoviraux oncolytiques armés exprimant des protéines hyperfusogènes du virus parainfluenza de type 5.

RESUME

     Les vecteurs adénoviraux oncolytiques constituent une voie de recherche intéressante en thérapie anti-cancéreuse. Ces agents infectieux dérivés de l’Adenovirus humain de sérotype 5 sont génétiquement modifiés pour infecter et détruire les cellules tumorales. De nombreux types de modifications sont possibles pour restreindre l’infectivité des vecteurs aux seules cellules cibles, limiter la réplication virale aux cellules tumorales et insérer dans le génome viral des transgènes dont l’expression augmente l’efficacité anti-tumorale des vecteurs. Parmi ces transgènes, les protéines de fusion d’origine virale sont particulièrement intéressantes. Ces glycoprotéines exprimées à la surface de nombreux virus enveloppés sont capables d’induire une forte cytotoxicité s’étendant aux cellules non transduites, de modifier l’architecture du tissu tumoral par fusion cellulaire, et d’induire une réponse immune anti-tumorale bénéfique. L’insertion de gènes codant pour ces protéines de fusion dans des vecteurs adénoviraux (réplicatifs ou non) a été réalisée par d’autres groupes et semble prometteuse.

La première partie de cette thèse a consisté en un travail d’ingénierie de mutants hyperfusogènes à partir de la protéine F du virus Parainfluenza de type 5 (F-PIV5). Une banque de mutants a été créée par mutagénèse dirigée en colligeant les mutations déjà décrites dans la littérature et en insérant de nouvelles, déterminées grâce à l’étude structurale de la protéine F-PIV5. Ce travail a permis d’analyser les mutations critiques impliquées dans le phénomène de fusion de F-PIV5 et de créer des mutants originaux hyperfusogènes et autonomes.

La deuxième partie de cette thèse a consisté à insérer 3 de ces gènes dans des vecteurs adénoviraux réplicatifs. Ces vecteurs ont pu être produits à hauts titres, ont induit la fusion de cellules tumorales et ont montré leur efficacité anti-tumorale in vitro sur des lignées de mélanomes humains.

     Enfin, un modèle de tumeur solide vascularisée a été utilisé sur œuf embryonné. Ce modèle a montré sa grande facilité d’emploi et sa fidélité histologique par rapport à des métastases de patients. Les vecteurs adénoviraux réplicatifs et fusogènes construits au cours de cette thèse y ont été testés, et ont prouvé leur pouvoir cytolytique et fusogène en masse tumorale solide de mélanome.

 

Mots clés

Adenovirus, Glycoprotéine de fusion, Parainfluenza de type 5, Ingénierie, Mélanome.

 

ABSTRACT

         Oncolytic adenoviral vectors are emerging as promising anti-cancer therapies. These infectious agents derived from human Adenovirus serotype 5 are genetically engineered to infect and kill tumor cells. Several modifications are brought to transduce specifically target cells, restrict the viral replication to tumor cells and insert transgenes in the viral genome in order to enhance anti-tumor efficiency. Among these transgenes, viral fusogenic proteins are of particular interest. These glycoproteins are harbored at the surface of enveloped viruses. They are able to induce strong cytotoxicity (including to non transduced cells), to modify tumor tissue architecture through cell fusion, and to induce beneficial anti-tumor immune response. Replication competent or incompetent adenoviral vectors expressing such fusogenic genes have been constructed by other groups and seem to be promising.

The first part of this thesis focused on the engineering of hyperfusogenic mutants of the F protein of the Parainfluenza virus type 5 (F-PIV5). A library of mutants was created, combining different mutations described in the literature together with original mutations determined through the structural study of F-PIV5. This work analyzed the critical mutations involved in the fusion process of F-PIV5 and allowed the creation of hyperfusogenic and autonomous mutants.

In the second part of this work, 3 hyperfusogenic genes were inserted into replication-competent adenoviral vectors. These vectors were produced at high titers, induced fusion in tumor cells and showed enhanced cytotoxicity on human melanoma cell lines.

Finally, a three-dimensional model of vascularized tumors was implemented on fertilized chicken eggs. This model was easy to handle and allowed high fidelity to the histology of human metastases. The fusogenic replication-competent vectors constructed in this thesis were tested on this model, and showed cytotoxicity and fusogenicity on solid melanoma tumor masses.

 

Key words

Adenovirus, Viral fusion glycoproteins, Parainfluenza virus type 5, Engineering, Melanoma.